实验一 种子发芽毒性试验
种子在适宜的条件（水分、温度和氧气等）下，吸水膨胀萌发，在各种酶的催化作用下，发生一系列的生理、生化反应。但是，当有污染物的存在时，污染物会抑制一些酶的活性，从而使种子萌发受到影响，破坏发芽过程，因此，通过测定种子的发芽情况，如小麦，黑麦等种子的发芽势和发芽率，就可以预测和评价环境污染物对植物的潜在毒性和生物有效性。
1.1 材料和方法
（1）材料
选择发育正常、无霉、无蛀，完整而没有任何损坏的小麦种子或者其他种子，品种不限，但是，要求所取样品具有代表性。
（2）方法
在一定温度、湿度和光照条件下，用滤纸作发芽床，分别在第3天和第7天测定发芽势和发芽率。
1.2 实验前的准备工作
（1）培养皿用洗液或洗衣粉涮洗干净，除去表面污物，然后用自来水冲洗干净，晾干备用，在皿盖侧面贴上标签，注明浓度、序号及使用人。
（2）配对污染物梯度浓度溶液（低、中、高）。每种浓度试液设2个平行试验，以无离子为水为对照组。
1.3 实验步骤
（1）在培养皿（直径9 cm）内放入等径滤纸两张做发芽床。发芽床的湿润程度对发芽有着很大影响，水分过多妨碍空气进入种子，水分不足会使发芽床变干，这两种情况都有可能影响发芽过程，使实验结果不准确。在发芽床上加入10mL试液，加入时避免滤纸下面产生气泡。然后用镊子将种子腹沟（种子腹面凹陷处为腹沟）朝下，整齐地排列在发芽床上，粒于粒之间的距离要均匀，避免相互接触，以防发霉种子感染健康种子，每个发芽床上都摆放着100粒小麦，盖上培养皿，置于20~25℃温箱中或者常温下室内进行培养。为了保证种子发芽条件的适宜，在发芽期需要每天观察发芽情况及发芽床的湿润情况，必要时适当补充水分。
（2）发芽势与发芽率的测定，不同的植物种子有所不同，通常每日观察，分两期进行测定统计，第一期内发芽种子数量为种子的发芽势，第二期内发芽种子数量为发芽率。小麦种子的发芽势测定在第3天，发芽率测定在第7天。
（3）种子发芽后应具备的特征是：小麦等禾谷类作物，在正常发育的幼跟中，期其主要长度不短于种子长度，幼芽长度不短于种子长度的1/2者，为具有发芽能力的种子，以此标准进行观察、计数。
（4) 发芽势与发芽率的计算，分别于第3天和地7天测定记录小麦发芽的情况，将感染霉菌的种子要及时除去。
发芽势（%）=
×100
发芽率（%）=
×100
1.4 结果与讨论
（1）结果报告：种子名称，来源，每种浓度处理的种子数，培养条件，污染物的每种浓度处理组和对照组的发芽率和发芽势的平均值。
（2）本实验结果说明了什么？是否还需要进一步做实验证实？
（3）影响小麦发芽的主要因素是什么？试从植物种子发芽生理角度做分析。
实验二 污染物对植物气孔影响的比较观察
2.1 目的与要求
（1） 用显微镜观察，比较自然条件下生长的不同生态类型植物的气孔数目、分布密度，从而认识植物对环境的适应性。
（2） 观察污染物对气孔形态变化的影响，并了解植物气孔对环境变化的反应。
2.2 实验原理
气孔是植物与外界环境进行CO2和O2气体交换和水分蒸腾的主要通道。在不同环境条件下，生长的植物生态类型是不同的，其气孔数目分布也是不同的，并且随环境因子的变化灵敏地改变开度。
2.3 实验材料、仪器和药品
旱生植物： 小叶棉鸡儿（Coragan micnophylla）
羽茅（Achnatherum Sibiricum）
中生植物： 蚕豆（Vicia faba）
小麦（Triticum aestivum）
冬青（Ilex Purpurea）
阴生植物： 水稻（Oryza sativa）
显微镜、显微镜测微尺、镊子、解剖针、棉签、盖玻片、载玻片、滴瓶、纱布、洗瓶、镜头纸；
火棉胶、乙二醇、异丁醇。
2.4 实验步骤
气孔数目及密度的测定：
（1）每种生态类型植物选定一种，在已选定种的植物中再选定一株，于此株上选定三片健康叶片。洗净、擦干，用棉签将5%火棉胶分别涂在已选定的上表皮和下表皮上。
（2）数分钟撕下火棉胶膜，用镊子和解剖针将膜平放在载玻片上，盖上盖玻片，而后置于显微镜下迂回观察，计算视野中气孔数目（根据具体情况采用低倍镜或高倍镜）。在膜的不同部位进行5~6次计数，求其平均值。
（3）气孔密度的测定：用目镜测微尺测量显微镜视野的直径（目镜测微尺的使用见附录），求其半径r。若半径r为已知，根据公式S=
r2（S为面积），计算视野面积。
（4）根据所观测数据，分别求出每种植物的上表皮和下表皮气孔的密度，并以“气孔数/mm2”表示。
气孔开闭情况的观测：
用乙二醇和异丁醇按不同比例混合得到不同粘度的液体，不同粘度的液体由于表面张力的不同，对植物叶片浸润能力也有一定的差异。液体粘度愈小，浸润力愈强，愈易沿着气孔浸润到叶肉内。气孔开度愈大，愈易被液体浸入；气孔开度愈小，愈不易被液体浸入。因此，借助于不同粘度的污染物浸入植物体，可以相对地比较观测气孔的开闭情况，在其基础上可开展污染物对气孔开闭影响的观察与比较研究。
气孔开闭测定的具体观察：
首先，按下表配制不同粘度的混合液盛于滴瓶中，备用。
不同粘度混合液配制方法
混 名称 | I | II | III | IV | V | VI |
乙二醇（%） | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
异丁醇（%） | 90 | 80 | 70 | 60 | 50 | 40 |
气孔开度 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
合液编号
闭 开
以羽茅、蚕豆、冬青、洋秀球、小麦等不同类型的植物为材料，选择这些植物的健康叶片，用纱布擦去表面的灰尘。而后往叶子表面滴一滴I号液体（滴在叶上表面或下表面视气孔分布情况而定）。若在数秒内（具体时间由实验者酌情而定）有暗绿色小斑点出现，表示I号液体已浸入叶内；接着在相邻处滴一滴II号液体（如果叶片太小，可在另一片同龄叶片上滴），如有暗绿色斑点出现，再滴III号液，如III号液体不能浸入时，则气孔开度数值可用“2”表示；如果III号液体能浸入叶片，而IV号液体却不能浸入时，气孔开度数值可用“3”表示；如IV号液体稍能浸入，其程度相当3~4之间，则气孔开度作为3.5。其余依次类推。确定液体号开度后，用5%火棉胶涂于叶片上，数分钟后撕下火棉胶膜，置显微镜下观察气孔开度。
每组用一种污染物（不同粘度的混合液），在两种植物叶片上进行气孔开度测定，测定取三个以上胶膜，在显微镜下用目微尺测定20个以上气孔的最大宽度，求其平均值。（气孔开度以u为单位）。
2.5 结果与讨论
2.6 思考题
为什么可以用叶片气孔的开闭来比较研究污染气体或其他污染物对植物的毒性作用？
附录：显微镜测微尺的使用
测微尺分目微尺和台微尺，两种配合使用。目微尺系一块圆形玻片，中央刻一条5mm或10mm长的等分线，共分50个小格或100个小格，使用时将目微尺装入目镜中。台微尺是一块特制的载玻片，其中央有一条1mm长的等分线，共分100个小格，即每个小格为10μm（0.01mm）。使用时，将台微尺置于载物台上。
在一定的放大倍数下的目镜和物镜的组合，根据目微尺上的刻度与台微尺上刻度相重合的读数，可以计算目微尺上每一刻度的大小，例如：若目微尺上的50个分格恰恰等于台微尺的10个分格，则10÷50×0.01=0.002mm。即目微尺上的每一个分格等于2μm。由于目微尺每一个分格的长度为已知，所以在不同放大倍数下即可测定显微镜视野中物体的大小。
实验三蚕豆根尖微核实验
生物细胞中的染色体在复制过程中常会发生一些断裂，在正常情况下，这些断裂绝大多数能自己修复。如果生物细胞在早期的减数分裂过程中受到辐射或环境中其他诱变因子的作用，细胞染色体DNA收到损伤，一起染色体断裂形成断片，由于缺少了着丝点而不能随纺锤丝移动到细胞两极而游离在细胞质中。当新细胞形成时，这些断片就形成了大小不等与主核颜色一致的圆形结构，分布在主核的周围，成为微核。
微核是生物细胞染色体畸变类型之一。微核率和个体分布可反映外界环境因素损伤染色体的强度。采用微核监测技术可以预测和评价环境污染物对生物的潜在危害。
植物微核实验材料一般选用蚕豆和紫露草两种。由于蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量多、对诱变剂反应敏感，所以常选用蚕豆根尖细胞为实验材料。
3.1实验目的
微核是生物细胞染色体畸变类型之一。微核率和个体分布可反映外界环境因素损伤染色体的强度。采用微核监测技术可以预测和评价环境污染物对生物的潜在危害。
3.2 实验原理
在化学和物理因素的作用下，细胞染色体DNA受到损伤，引起染色体断裂，染色体落后等现象。在细胞分裂末期染色体断片和落后染色体，不移向两极，在子细胞形成时它们游离在细胞中，在同期细胞中形成与主核颜色一致的圆形结构，成为微核。
3.3 实验材料、仪器和药品
实验材料：蚕豆
实验仪器：显微镜、镜头纸、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、水浴锅、温度计、试管架、试管、小玻璃瓶、滤纸、尼龙纱、纱布、白磁盘、计数器、洗瓶、50mL烧杯、电热炉
实验药品：Carnoy固定液、Schiff试剂、醋酸洋红、盐酸、保存液（70%酒精）、Cd(NO3)2溶液（50mg/L）、1mol/L盐酸
3.4 实验步骤
蚕豆的催芽和处理
（1）浸种：将发育正常、无损伤的蚕豆种子用盛有25℃自来水的盘中，浸泡2-3d，至完全吸胀，并露出一点小芽。在此期间每天至少换水两次，换用的水最好事先置于25℃预温。也可以将盘放入温度以调为25℃的生化培养箱中。
（2）催芽：待种子吸胀后，挑选发育良好的种子，置于放有煮过纱布的白磁盘中，并用湿的纱布包住保持温度，在27-28℃的生化培养箱中或是人工气候调节箱中，催芽36-48h，待种子初生根至2-3cm，根毛发育良好即可实验。
（3）用Cd(NO3)2溶液（50mg/L）处理根尖：将蚕豆放入盛有Cd(NO3)2溶液（50mg/L）的白磁盘中，使幼根浸入处理溶液中，静止4h，用蒸馏水处理做对照。
（4）根尖细胞修复培养：将处理后的幼根，用蒸馏水冲洗3次，每次2-3min，洗净后的幼根，放在盛有蒸馏水的白磁盘中修复过夜。
（5）固定根尖细胞：将修复好的幼根，自根尖顶端切下1cm长的幼根放入盛有Carnoy固定液的小瓶中，固定4h。固定后，将根转入盛有保存液的小瓶。
（6）染色：镜检前，取出幼根用蒸馏水冲洗三次，放入盛有1mol/L盐酸的试管中，60℃水浴水解6-8min，弃去盐酸，用蒸馏水冲洗三次，放置在吸水纸上，吸取表面水分。再放入盛有Schiff试剂的小瓶中，在避光条件下染色1h。
2制片
在载玻片上用刀片轻轻切下1mm左右舍去，另切约1mm且横切面向上，加1-2滴醋酸洋红进行复染。盖上盖玻片，用铅笔轻轻敲打，使细胞分散开开。再用吸水纸吸去多余的染色液（注意：复染时间控制在2-3min，否则染色太深，微核不易辨别），而后镜检。
3镜检
先用低倍镜观察，找到分生区，分散均匀、膨大、分散项较多的部位，而后转换高倍镜（物镜40×倍）进行检查，镜检顺序如图:
|
图: 镜检顺序
每实验组制片8张（4张对照，4张同一浓度实验组）。每片至少镜检20个视野，每个视野计数50个分生组织细胞。在分生组织细胞中观察微核（MCN）。
微核的标准如下：①微核为主核的1/3以下，且与主核分离。②主核的核膜是完整的，微核和主核的颜色一致（转动显微镜的微调，观察微核颜色是否与主核一致，注意区分细胞质中的颗粒物和染料的残渣）。③微核形态可为圆形、椭圆形。观察细胞数和微核出现率，以手持计数器进行计数，将每片镜检结果记录于下表3-1中，然后进行计算。
表3-1微核记录
处理 | 制片编号 | 正常细胞数 | 产生微核细胞数 | 细胞总数 | 微核数 | 微核率/‰ |
0 | 1 | |||||
2 | ||||||
3 | ||||||
4 | ||||||
污染物浓度(mg/L) | 5 | |||||
6 | ||||||
7 | ||||||
8 |
微核率（‰）的计算公式如下：
微核率=微核数/(正常细胞数+产生微核细胞数）×1000
结果与讨论
（1）产生微核的实质是什么？在应用微核产生率评价环境污染物对环境生态系统影响时，应该注意什么？
（
2）试分析5mg/LCd(NO3)2溶液促使蚕豆根尖产生微核的原因。
附：微核图片
实验四 脱氢酶活性测定
4.1 试验原理
脱氢酶的正式命名应是AH:B氧化还原酶，它能酶促自一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶广泛存在动植物组合和微生物细胞内。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而又不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。通过测定活性污泥或土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对污泥或土壤中有机物氧化分解能力，即污泥酶或土壤酶的活性。
利用已知受氢体能接受脱氢酶脱出的氢原子，如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride），俗称红四唑，接受氢后变成红色的三苯基甲臜（TF，triphenyl formazan），根据产生红色的色度进行比色定量分析，以判断脱氢酶活性。
TTC作为受氢体，其还原过程可用下式表示。
根据红色的深浅，测出相应的吸光值（A值），求出脱氢酶的活性。通常A值越大（红色深），脱氢酶活性越高。
4.2材料与方法
（1）材料活性污泥悬浮液或土壤悬浮液
（2）方法分光光度法
要点⑴所有操作应当尽量在避光条件下进行。脱氢酶最适反应条件，温度30~37℃，pH值7.4~8.5。
⑵取用甲醛时一定要小心，不要碰到皮肤上，如若沾到皮肤上要迅速用自来水冲洗。
4.3实验步骤
1 绘制TTC标准曲线
（1）配制系列浓度的TTC标准溶液。先取5支50mL带塞闭塞管，按顺序尽快分别加入0.36% Na2SO3溶液2.5mL，Tris-HCl缓冲液（pH值7.6）7.5mL，再分别吸取0.4% TTC溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，放入5支比色管中，用蒸馏水定容至50 mL，使成8μg·mL-1、16μg·mL-1、24μg·mL-1、32μg·mL-1、40μg·mL-1系列浓度。同时另取一支50mL比色管，加入0.36% Na2SO3溶液2.5mL，Tris-HCl缓冲液（pH值7.6）7.5mL，加入蒸馏水50mL，作为空白对照。
（2）向每支比色管中各加入少许（十几粒）连二亚硫酸钠（Na2S2O4）混匀，TTC全部还原成红色的TF。
（3）向各管滴加5mL甲醛终止反应，摇匀后再加入5mL丙酮振荡摇匀，37℃水浴10min。
（5）以A值为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。
2 活性污泥脱氢酶活性的测定
（1）活性污泥悬浮液的制备取50mL活性污泥液（约1.5~3g·L-1）放入三角瓶中，加入数粒玻璃球剧烈摇动将污泥打碎。4000r·min-1离心5min，弃去上清液，再用生理盐水补足水分，悬浮，洗涤，离心，反复三次。最后用生理盐水补至原体积。
（2）取4个40mL具塞离心管（1个对照，3个平行），分别加入Na2SO3溶液0.5 mL，Tris-HCl缓冲液（pH值7.6）2mL，污泥悬浮液2mL，0.4%TTC液0.5 mL（对照管不加TTC液，以0.5mL蒸馏水取代），使最终体积都为5mL，盖紧塞子。
（3）将离心管摇匀，立即加入37℃水浴中培养10min（以显色为准）。
（4）各管分别加入0.5mL甲醛终止反应。再向各管分别加入5mL丙酮振摇数十次，37℃水浴保温10min。
（5）4000r·min-1离心5min，取上清液在485nm波长下测定A值并在标准曲线上查出相应的TTC浓度。
3 土壤脱氢酶活性的测定
（1）取3个50mL具塞三角瓶，分别称取通过2mm筛的土样5g，加入三角瓶中，再加入5mL 0.4% TTC液，另取一个50mL具塞三角瓶加入同样土样的灭菌土5g，也加入5mL 0.4% TTC液，作为对照。
（2）将以上4个具塞三角瓶避光，37℃保温培养12~24h。
（3）培养结束后，加入5mL甲醛终止反应，再分别加入5mL丙酮振荡并在37℃保温10min，转入离心管。
（4）4000r·min-1离心5min，取上清液在485nm波长下测定A值，在标准曲线上查出相应的TTC浓度。
4.4结果与讨论
（1）活性的计算
脱氢酶活性=ABC
式中，A为标准曲线上查出的TTC浓度（μg·mL-1）；B为培养时间校正值（h）；C为比色时稀释倍数，当A值大于0.8时，要适当稀释，使A值在0.8以下。
（2）氢酶活性的因素有哪些？
（3）氢酶（LDH）在NAD+的递氢作用下，使乳酸脱氢生成丙酮酸。丙酮酸在碱性溶液中与2，4-二硝基苯肼生成2，4-二硝基苯腙使溶液成棕色。颜色的深浅与丙酮酸浓度成正比。请设计一个测定动物肝脏乳酸脱氢酶活性的实验。
要点丙酮酸标准溶液配制——称取丙酮酸钠11mg，用0.05mol·L-1硫酸溶解后，定容至100mL，置冰箱中保存。
实验五 SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法
5.1 试验原理：
定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚自氧化的方法测定酶活力，利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
5.2材料与方法
1 试剂：
（1）pH 7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液：
A液：称取17.9g Na2HPO4•12H2O于容量瓶中定容至1L；
B液：称取7.8g NaH2PO4•2H2O于容量瓶中定容至1L；
取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH 7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液。
（2）C液：pH 8.20，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)- 盐酸缓冲液(内含1mmol/L EDTA•2Na)：
称取1.2114gTris和37.2mg EDTA•2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。
（3）0.1 mol/L盐酸溶液：量取2.1 mL 12mol/L盐酸，蒸馏水定容至250mL。
（4）10mmol/L盐酸溶液：量取10mL 0.1 mol/L盐酸，蒸馏水定容至100mL。
（5）D液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：
称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定容至100mL。
2 仪器：
冷冻离心机；水浴锅；电子天平；紫外-可见分光光度计；精密酸度计，精确到0.01pH；10mL比色管；10mL离心管；玻璃乳钵。
5.3 实验步骤
1SOD粗酶液的提取
称取叶片1g，置于研钵中研磨，加入3mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，加入少量石英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL至离心管中，于4℃10000r/min离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2邻苯三酚自氧化速率测定
在25℃左右，于10mL比色管中依次加入C液体2.35mL，磷酸缓冲液2.00mL，D液0.15mL。加入D液后立即混合均匀并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率ΔA325(min-1)。
3 样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定
样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按照2步骤分别加入一定量样液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2ΔA325(min-1)，即ΔA'325(min-1)。
SOD活性测定加样表
试液 | 空白 | 酶提取液1 | 酶提取液2 |
C液/mL | 2.35 | 2.35 | 2.35 |
磷酸缓冲液/mL | 2 | 1.5 | 1.5 |
样液/mL | 0 | 0.5 | 0.5 |
D液/mL | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
于10mL比色管中立即混合均匀然后倾入比色皿 | |||
式中:
U/mL一SOD酶活力单位;
△A325一邻苯三酚自氧化速率;
△A`325一样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率;
V一所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL);
D一酶液或样液的稀释倍数;
V1一样液总体积，单位为毫升（mL）；
m一样液质量，单位为克（g）
4.5一反应液总体积，单位为毫升(mL)。
计算结果保留三位有效数字。
实验六 污染物对乙酰胆碱酯酶的影响
6.1 实验原理
生物体内的胆碱酯酶，在正常状态时，能将神经冲动时所产生的乙酰胆碱分解成乙酸和胆碱，这样使生物的神经传导能正常进行。当生物体接触神经毒性物质如氨基甲酸酯类农药后，使体内的胆碱酯酶活性受到抑制，不能分解乙酰胆碱，从而破坏了神经系统的正常传导。
在一定条件下（温度、pH值），酶反应速率同酶使用量、作用时间呈近似线性体系。
取一定量的乙酰胆碱与鱼脑胆碱酯酶作用，水解后，剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用，生成乙酰羟胺，它们在酸性溶液中与三氯化铁作用，生成深褐色异羟肟酸铁络合物，其颜色的深浅与乙酰胆碱量成正比，用分光光度法测出剩余乙酰胆碱的含量，从而间接的测定胆碱酯酶的活性。
6.2材料与方法
1 材料
（1）鲤鱼或鲫鱼。
（2）涕灭威（氨基甲酸酯类农药）。
（3）氯化乙酰胆碱标准溶液。
（4）贮备液精确称取0.073g氯化乙酰胆碱，溶于10mL 0.001mol • L-1乙酸钠溶液中，即为0.04mol • L-1贮备液，即1mL中含有40μmol • L-1的乙酰胆碱（因乙酰胆碱易吸潮，称量时要快，最好用带盖称量瓶）。
（5）使用标准液取1mL贮备液，用0.001mol • L-1乙酸钠溶液稀释至10mL，为0.004mol•L-1，即为1mL中含有4μmol • L-1的乙酰胆碱。
（6）0.37 mol • L-1 FeCl3 (FeCl3 10g，溶于100mL 0.1 mol • L-1盐酸溶液中，贮于棕色瓶中)。
2 仪器
恒温水浴槽（每个实验台一个），振摇器（每个实验台一个），分析天平，723A可见分光光度计、722可见分光光度计、722S可见分光光度计、752N紫外可见分光光度计、755B紫外可见分光光度计，比色皿。（使用前请详细看仪器前方操作规程）
6.3实验步骤
1 制备乙酰胆碱标准曲线
分别取乙酰胆碱使用标准液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL 于试管中，然后用磷酸缓冲液（pH值7.2）添加到2mL，摇匀，各加碱性羟胺4mL（临用前20min将盐酸羟胺与等体积3.5 mol • L-1 氢氧化钠混合即成），振摇3min 后再加1:2盐酸溶液2mL，振摇1min，最后加2mL三氯化铁，摇匀后待测（空白管先加1:2盐酸摇匀，然后再加碱性羟胺）。10min后分别将溶液移入的比色皿中，并在525nm波长下测定各管的吸光值，以空白对照液调零。以吸光值为纵坐标，以乙酰胆碱浓度为横坐标绘出标准曲线。
2 样品分析
（1）取染毒鱼和对照鱼，设两个浓度组，每组各取一条鱼，用剪刀在鱼头脊背面剪成三角状，剥去头顶骨，然后用镊子取出鱼脑组织，以滤纸吸去鱼脑表面的血丝和非脑组织。
（2）称取20mg鱼脑组织，放入已冰浴预冷的匀浆器中，然后加入1mL磷酸缓冲液（pH值7.2）进行匀浆。然后再加同样的缓冲液9mL于匀浆器中，使每毫升鱼脑匀浆液中含鱼脑组织2mg 。
（3）取两个试管，各加入1mL乙酰胆碱使用标准溶液，再分别向两个试管中加入1mL染毒鱼及对照鱼鱼脑组织匀浆液，然后放入37℃恒温水浴槽中，温浴20min 。
（4）取出试管并立即分别加入4mL碱性羟胺，充分振摇1min后再分别加入2mL 1:2盐酸，充分振摇。最后再分别加入2mL三氯化铁，再次充分振摇，然后用快速滤纸过滤（除去蛋白质及杂质）。
（5）将滤纸移入比色皿中，在525nm波长下测定吸光度，仍以试剂空白调零。
6.4结果与讨论
（1）酶活性的计算
式中，M为标准乙酰胆碱的物质的量浓度（μmol•L-1）；m 为样品水解后残留的乙酰胆碱的物质的量浓度（μmol•L-1），由工作曲线查出；3为作用时间20min 除60min所得；2为鱼脑组织2mg。
（2）讨论：检验胆碱酯酶的活性有何毒理学意义？
实验七 藻类急性毒性实验
7.1实验原理：
藻类是最简单的光合营养有机体，种类繁多，分布广泛，是水生生态系统的初级生产者。藻类生长因子包括光照、二氧化碳、适宜的温度、pH值及氮、磷、微量元素等其他营养成分，这些因子的变化会刺激或抑制藻类的生长。在一定环境条件下，如果某种有毒有害化学物质及其复合污染物进入水体之后，藻类的生命活动就会受到影响，生物量就会发生变化。所以通过测定藻类的数量和叶绿素a的变化，就可以评价有毒有害污染物对藻类生长的影响以及对整个生态系统的综合环境效应。
材料与方法
（1）材料
血球计数板（1块16×25）、盖玻片（1盒）、50毫升烧杯（4个）、滴管（1支）、10毫升移液管（1支）、吸耳球（1个）、10毫升量筒（1支）、离心管（4支）、试管架、匀浆器（1套）、记号笔（1支）、计数器（1个）、碳酸镁（1瓶）、药匙（1把）、擦镜纸、纱布等。
可采用蛋白核小球藻（Chlorella pyrencidosa）、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、水华鱼腥藻（Anabaena flos-apuae）、小环藻（Cyclotella sp.）、菱形藻（Nitzschia sp.）斜生栅藻（Scenedesmus obliqnus）等作为试验藻种，也可以直接用某自然水体的混合藻为实验材料。
（2）方法
以培养一定时间的单一藻或混合藻为对照，在完全相同培养条件下，在加入一定浓度某有毒有害污染物后，定时、定点取样，直接测定水中藻浓度（个·mL-1）及叶绿素a含量的变化。藻浓度用血球计数板计数法；叶绿素a的测定用分光光度法。
要点（1）实验用玻璃器皿一般不用重铬酸钾等洗液洗涤，以防其他重金属离子影响实验结果。
（2）由于光照、通气条件对藻类生长影响甚大，因此各组实验条件必须一致。
7.3 实验仪器
723A可见分光光度计、722可见分光光度计、722S可见分光光度计、752N紫外可见分光光度计、755B紫外可见分光光度计，比色皿。（使用前请详细看仪器前方操作规程）
7.4 实验步骤
1 藻种预培养
将所得到的实验藻种移种至盛有培养基的三角瓶中，在实验所设温度和光强（同正式实验）下，通气或在三角瓶内保留足够空间培养，隔96h移种1次，反复2~3次，使藻种生长达到同步生长阶段，以此作为实验藻种。每次移种均需进行显微镜观察，检查藻生长情况和是否保持纯种。
预备实验
预备实验的目的在于探明污染物对藻生长影响的半数有效浓度（EC50）的范围，为正式实验打下基础，其处理浓度的间距可大一些，以便找到EC50值所在的浓度范围。
预备实验的方法与培养条件均同正式实验。
正式实验
（1）培养容器及容器的清洗一般要求质量好的硼硅酸玻璃容器，如果是研究痕量元素的影响则应选择特殊的硬质玻璃容器（Pyrex）。在同一批实验中，应自始至终使用一种类型的玻璃容器，以便比较实验结果。通常选用三角瓶作为培养容器，瓶口覆盖灭菌纱布（2~3层）。
（2）实验浓度的选择根据预备试验的结果，设计等对数间距5~7个污染物浓度，其中必须包括一个能引起实验藻的生长率下降约50%的浓度，并在此浓度上下至少各设两个浓度，另设一个不含污染物的空白对照。各浓度组均设2个平行样。
（3）培养液的制备将储存母液混合、稀释，按配方配制培养基，按一定体积分装在各个三角瓶中经121℃高压灭菌20min，或经0.45µm滤膜过滤除菌。由于限制CO2交换的是介质的表面积与体积之比，所以在分装培养液时必须预留一定空间。通常所留空间与液体表面之比是：40mL液体/125mL三角瓶；60mL液体/250mL三角瓶；100mL液体/500mL三角瓶，且
液体体积＝培养基体积＋污染物溶液体积＋藻种液体体积
吸取一定体积母液加到灭菌后的培养液中，摇匀，使成所需浓度。
（4）接种培养将达到同步生长的藻种培养液充分摇匀，吸取一定体积加至各组培养液中。一般初始藻种浓度可采用（1~5）×106个·mL-1，接种量控制在10%~20%。
（5）培养条件蓝藻和硅藻，在（24±2）℃，白色荧光灯光照下培养，光强（2000±200）lx；绿藻在同样的温度下，（4000±400）lx的条件下培养。培养容器可置摇床上振荡（110次·min-1），也可人工通以含CO2 3%的空气，以便空气交换。光暗比为14h︰10h或12h︰12h。
（6）生长测定在藻类毒性实验中，应定时取样测定藻类的生长情况，一般为24h或48h取样一次。在96h取样测定污染物对藻类生长影响的EC50值，即与对照相比，生长率下降50%的污染物浓度。确定藻类生长的指标较多，因而在设计藻类急性毒性实验时，必须考虑所有相关的环境因素，根据实验目的和实际条件选择测试指标。常用的测试指标如下。
a.吸光值（A）用分光光度计，使用4cm比色皿在波长600~750nm处直接测定藻液的吸光值。
b.细胞数在显微镜下用血球计数板或0.1mL计数框直接计数。如果是丝状藻类，则先用超速搅拌器或超声波处理丝状藻体团分散后，再行显微计数。同一样品计数两次，计数结果之差如果大于±15%，则需计数三次。
注：本实验所采用血球计数板均为25×16，血球计数板的构造如下图：
计数方法：
数出小网格区域（共400个小格）中左上角的16个小格中的细胞数，再分别数出左下角、右上角、右下角及中间的16个小格中的细胞数，并将五个区域细胞数加起来，得到共计80个小格中的细胞数。同一样品计数两次（实验直接采用两个计数区作为平行样品），取二者平均值（若两次结果之差大于15%，需计数三次，取平均值）。结果按下式计算：
每毫升细胞数（个/mL）=平均值÷80×4000×1000×稀释倍数（未经稀释此值为1）
c.叶绿素a含量测定取一定体积的藻类，3000r/min离心10min，将沉出物拌入少量碳酸镁，匀浆，95%乙醇（或80%丙酮）萃取，4℃，放置2~4h后，4000 r/min离心10min，取上清液，用分光光度计在波长665nm和649nm分别测定吸光值（A665、A649）。以体积分数95%乙醇作为空白。
要点（1）提取液的A665要求在0.2~1.0之间，若A665小于0.2时，应增加取水样量；若A665大于1.0时，可稀释提取液或减少取水样量。
（2）光对叶绿素有破坏作用，实验操作应在弱光下进行，且匀浆时间尽量短。
（3）色素提取液若混有其他物质而造成浑浊，将影响吸光值的测定，应重新过滤或离心。
95%乙醇提取叶绿素a，浓度Ca的计算公式（经验公式）如下（不同提取溶剂采用不同经验公式）。
Ca＝13.95 A665－6.88 A649
再根据所取藻液的体积求出藻液叶绿素a的含量（mg·L-1）。
7.5结果与讨论
（1）按下表记录实验数据。
实验记录表时期：
试验藻种名称： 藻种编号： | ||||||||||||||||
标准培养基： | 被试毒物： | |||||||||||||||
条 件 实 验 | 控温： | 初 始 测 定 | pH： | |||||||||||||
光照： | 藻细胞数： | |||||||||||||||
光暗： | 光密度： | |||||||||||||||
通气情况： | 叶绿素a： | |||||||||||||||
处理 | 24h | 48h | 72h | 96h | ||||||||||||
组别 | 瓶号 | 浓度 | 细胞数 | Ca | A | 细胞数 | Ca | A | 细胞数 | Ca | A | 细胞数 | Ca | A | ||
对照 | 1 2 3 |
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处理Ⅰ | 4 5 6 |
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处理Ⅱ | 7 8 9 |
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处理Ⅲ | 10 11 12 |
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处理Ⅳ | 13 14 15 |
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处理Ⅴ | 16 17 18 |
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（2）按下法求出96hEC50值。各组设2个平行样，取其平均值，在半对数坐标纸上，以试验浓度为纵坐标，以
为横坐标，用内插法求出对藻生长影响下降50%的污染物浓度，即为EC50。
（3）为什么每个实验组要有2个平行样？为什么污染物浓度设计要采用等对数间距的5~7个浓度？
（4）为什么可以用藻类叶绿素a的含量来表征藻的生物量？
实验八枝角类急性毒性试验
8.1 目的与要求
通过实验，了解并掌握枝角类急性中毒试验的基本条件和方法。
8.2 实验原理
枝角类（Cladocera）属于甲壳纲、腮足亚纲，通称蚤类，俗称水蚤或红虫。广泛分布于各地淡水水体，是浮游生物的主要类群之一。我国已知有130余种之多。由于他们具有繁殖快，生活周期短，来源广泛，易于培养，实验方法简便及对环境中的毒物具有敏感性等特点，故国内已广泛作为测试生物。
8.3 实验材料、仪器和药品
（1）实验材料
最常使用的大型蚤（Daphnia magna）、蚤状蚤（D.pulex）及透明蚤（D.hyana）作为实验材料。也有用隆线蚤（D.carinata）、锯齿低额蚤（Simocephalus serrlutus）及多刺裸腹蚤（Moina macrocopa）等。
蚤类一般具有20~30个龄期不等（即雌蚤刚产下的幼蚤为第一龄，以后每脱一次增加一龄）。其生殖方式有单性生殖（孤雌生殖）与两性生殖的世代交迭现象。由于考虑到取材方便及幼龄期对污染物的敏感性较强，故通常选择孤雌生殖的雌性幼蚤作为材料，试验用蚤龄为8h±8h（1~2龄之间）。由于脱壳期对污染物的敏感性强，故在实验设计中，必须有足够长的实验时间。
本实验采用在室内培养的大型蚤作为材料，实验前将怀卵雌蚤吸出，分开喂养，12h以后以塑料纱过滤得幼蚤，用去余氯水洗涤三次。急性试验时不喂食，以免污染物浓度受到食物的影响。
（2）实验仪器
溶解氧测定仪、人工气候培养箱、广口滴管、烧杯、洗瓶、记号笔、白磁盘、pH计。
8.4 实验条件
（1）实验容器
蚤类培养一般用水族箱或培养缸。条件许可时也用恒流装置培养。水文保持在20℃左右，培养期间，其生物量以不大于150个/L为宜。
急性毒性实验一般采用150mL的玻璃容器，内放100mL实验液，每个容器放入10只实验蚤。而静态换水或慢性中毒实验需要用大容器及大实验液量，以保持实验蚤的正常活动空间及实验液中各种理化参数的相对稳定性。
（2）实验用水
配制实验液可用未受污染的江、河、湖池水，并滤去水中的悬浮物及其他生物。使用自来水时，必须进行人工曝气或静置2~3天，以除去水中的余氯，也可用蒸馏水，配方如下。MgSO430mg、CaSO430mg、NaHCO348mg、KCl2mg、去离子水100mL。调整pH值为7.4~7.8。
（3）水温
实验时的水温在20~25℃为宜。同一实验水温差幅不得超过±2℃。
8.5 实验步骤
1预实验
为确定正事实验的浓度范围，应先进行预实验。预实验的浓度范围可广些，在每个浓度中放入3~5只蚤，实验时间为24~28h，从中得出大部分存活的浓度。
2实验浓度选择
实验浓度的选择方法与藻类毒性实验方法相同（见第6.3节），一般常用浓度为10.0、5.6、3.2、1.8、1.0等。每个浓度设2~3个平行组，整个实验设一个对照组（即空白对照）。
正式实验至少需要两次重复。由实验结果求出半数致死浓度（LC50）值。
浓度设置根据对污染物特性的掌握情况而定，一般选择5~7个实验浓度，以其中能出现死亡率在60%左右和40%左右最为理想。
3实验液配制
毒性实验的污染物浓度以mg/L为单位，工业废水用稀释百分数表示。污染物需先配制成母液，然后在稀释到所需要的浓度。在实验过程中，由于污染物的挥发、容器的吸附及其他原因，易使实验液浓度减低，必须根据情况更换试液。
4蚤的移放
新生蚤体校，实验前应先用口径大于蚤体的吸管吸出，放置于表面皿中，移至解剖镜下，剔除雄性及损伤、病弱个体，然后移放如实验液中。
5实验指标
LC50是使蚤在预定时间内死亡50%的污染物浓度，如24h LC50，48h LC50等。
死亡标准（Andteson,1944）。一般蚤类中毒停止游泳之后沉至水底，但心跳和肠蠕动有时还会持续一段时间，大触电及刚毛偶尔也会动弹。在观察时，可轻轻摇动试液，观察1~2min，如停止活动可判断为死亡。
6实验时间
急性实验通常要经过48h才能完成，也有用24h或96h的。一般急性试验在48h内不喂食，以免毒物浓度受到食物的影响。
8.6 结果与讨论
（1）LC50值是用直线内插法求得。实验结果必须有使蚤存活半数以上及半数一下两个浓度。在半对数坐标纸上，以纵坐标为对数浓度，横坐标为存活百分数，将50%存活率上下两点连成直线，再在直线与50%存活相交点，引出与横坐标垂直线，与纵坐标交点所标示的浓度即LC50的值。
（2）实验报告
实验报告内容包括实验的日期、蚤种、龄期（或出生至实验开始的时间）、平均体长、来源、驯养条件、喂食情况；实验容器体积、实验液量、实验水温、用水来源及实验蚤数等。实验液的一般理化参数（如pH值、溶解氧、电导率、总硬度等）也需要加以说明，并写明其急性中毒症状。
（3）蚤类的急性毒性实验为什么可用于生态毒理学评价、工业废水排放管理、渔业水体保护和水质卫生评价等方面？
（4）求LC50和求EC50的方法有什么不同？
8.7 注意事项
（1）实验容器必须洗净，用蒸馏水充分冲洗，防止任何污染物污染。
（2）分离实验蚤时操作要细心、快速。挑去的蚤的大小力求一致，去掉体弱、损伤及雄性个体。
附录：试验浓度选择表
表1.根据对数纸上各间隔递进的二等分试验浓度选择：
一 | 二 | 三 | 四 | 五 |
10.0 | --- | --- | --- | --- |
--- | --- | --- | --- | 8.7 |
--- | --- | --- | 7.5 | --- |
--- | --- | --- | --- | 6.5 |
--- | --- | 5.6 | --- | --- |
--- | --- | --- | --- | 4.9 |
--- | --- | --- | 4.2 | --- |
--- | --- | --- | --- | 3.7 |
--- | 3.2 | --- | --- | --- |
--- | --- | --- | --- | 2.8 |
--- | --- | --- | 2.4 | --- |
--- | --- | --- | --- | 2.1 |
--- | --- | 1.8 | --- | --- |
--- | --- | --- | --- | 1.55 |
--- | --- | --- | 1.35 | --- |
--- | --- | --- | --- | 1.15 |
1.00 | --- | --- | --- | --- |
表2 根据分对数Olecilog各间隔试验浓度选择：
一 | 二 | 浓度对数 |
10 | --- | 1.00 |
--- | 7.94(或7.9) | 0.90 |
6.31(或6.3) | --- | 0.80 |
--- | 5.01(或5.0) | 0.70 |
3.98(或4.0) | --- | 0.60 |
--- | 3.16(或3.15) | 0.50 |
2.51(或2.50) | --- | 0.40 |
--- | 1.99(或2.0) | 0.30 |
1.58(或1.60) | --- | 0.20 |
--- | 1.26(或1.25) | 0.10 |
1.0 | --- | 0.00 |
实验九 BCA法测蛋白浓度
9.1实验原理
BCA实验以双缩脲反应为基础，具有与肽反应的优势。与双缩脲法相比该方法更加敏感，不容易受干扰。其原理是蛋白质与Cu2+的结合，Cu2+在碱性溶液中还原成Cu+，然后与两个分子的双喹啉-4-羧酸（Bicinchonininc Acid，BCA）形成紫色化合物，利用紫外可见分光光度计在562 nm波长下测吸光度值。铜离子的还原反应通过肽和氧化的氨基酸如酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸来实现。
9.2 试剂和仪器
实验试剂：双喹啉-4-羧酸（BCA）、牛血清白蛋白标准品、氢氧化钠、无水碳酸钠、酒石酸钠、碳酸氢钠、硫酸铜
实验仪器：pH计、紫外-可见分光光度计、金属恒温器（或恒温水浴锅）
9.3 实验步骤
（1）称取4.0 g NaOH溶于100 mL水中配制成浓度为1 mol/L的NaOH溶液储存于PE烧杯中；
（2）配制溶液A。在100 mL烧杯中加入50 mL H2O，然后依次加入并溶解下列物质。1.0 g双喹啉-4-羧酸（BCA）、2.0 g无水碳酸钠、0.16 g酒石酸钠、0.4 g NaOH、0.95 g NaHCO3。溶解后用之前配好的NaOH溶液调节pH值到11.25，然后将溶液转入100 mL容量瓶中定容。注意必须按照顺序加入并且在溶解后再加入下一物质。
（3）配制溶液B。称取1.0 g CuSO4·5H2O（Mr=249.7），加入25 mL H2O溶解。
（4）配制溶液C。溶液A和溶液B按照50:1的比例（体积比）配制成溶液C。溶液A和溶液B在室温下稳定，溶液C必须在使用前新鲜配制。15.3 ml溶液C：15ml A+0.3ml B。
（5）标准曲线的制备。首先用标准蛋白配制1 mg/mL BCA 标准溶液备用，准备1.5 mL微离心管并标号0-11。配制溶液C，在每个小离心管中加入950 μL的溶液C，然后在编号从1到11的离心管中依次加入0.5、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50 μL 1 mg/mL BCA标准溶液，再加入一定体积的水，离心管溶液总体积为1000 μL，标号为0的离心管中加入50 μL H2O作为空白对照。溶液加入完毕后，将微离心管37 ℃恒温孵育30 min，然后在562 nm处测吸光度值。根据蛋白浓度和吸光度值绘制标准曲线，并得到标准方程。
（6）样品测定。样品蛋白含量的测定过程和标准曲线一致。当样品蛋白浓度超出标准曲线范围时先对样品进行稀释。